負責我們認知、意識的神經活動主要發生于我們大腦內部，負責體表的一系列感覺有外周神經通路，而對于我們體腔內的內臟器官的感覺傳入和神經支配，則主要由迷走神經完成。迷走神經負責的組織器官多樣，功能也各不相同，但迷走神經核團是如何對各個內臟的傳入信息進行區分和編碼，目前了解的不甚清晰。不同器官傳入的神經元涉及種類繁多，對不同刺激產生應答，了解不同類型神經元的空間分布及分類特點，對于理解信息如何編碼匯聚非常重要。2022年3月，美國耶魯大學醫學院的常瑞實驗室與張樂實驗室合作在Nature上發表了一篇研究，通過使用RNAscope HiPlex結合單細胞測序、活體鈣成像等技術，對迷走神經元進行了空間及細胞活動特征的研究[1]。
作者先在小鼠不同器官內分別注射帶有熒光標記和不同barcode的逆行AAV病毒，以此標記不同器官來源的迷走神經。然后分離出標記好的迷走神經元做單細胞測序，篩選總結出大量靶標，及不同靶標在每類神經元中的相對表達量。隨后作者使用RNAscope HiPlex技術對篩選出的不同器官來源的迷走神經元中感興趣靶標進行了原位驗證，并將此方法稱之為“Projection-seq” （圖1）。在多個組織器官來源的迷走神經元中原位驗證結果與單細胞測序結果匹配良好，且各靶標相對表達量與單細胞測序接近。
圖1. Projection-seq驗證肺臟投射來源不同亞群迷走神經元的靶標分布。
隨后，作者在迷走神經元中泛表達鈣指示劑GCamP6s，并在Gpr65陽性神經元中表達紅色熒光蛋白指示劑，用于對神經元進行定位。通過對小鼠肺、食管、胃腸道等不同內臟器官或不同節段分別進行機械刺激，同時記錄迷走神經元的鈣反應情況，之后，再結合RNAscope HiPlex技術，對迷走神經元進行多靶標染色，通過紅色熒光蛋白定位，將RNA原位信息與鈣活動信息整合到一起。作者將此方法命名為“vCatFISH”。通過vCatFISH，得以讓我們看到對于相同器官的同一刺激，會有表達不同基因的神經元產生反應，說明對于同樣的刺激，在迷走神經元中也存在多個維度的編碼。神經系統通過對不同維度信息進行整合，最終幫助我們實現對刺激強度、時間、位置等具體細節的區分，從而使機體對不同情況進行應對。而本篇文章的工作幫助我們未來對神經活動進行解碼提供了一種新的選擇和啟發。
圖2. vCatFISH技術揭示了對于機體不同刺激反應的神經元的基因特征。
RNAscope技術是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司研發的RNA原位雜交產品，在近年來的生物檢測領域發展迅速。與傳統的RNA原位雜交相比，RNAscope技術屬于新一代RNA原位雜交技術，其特異性的雙Z探針設計避免了傳統長鏈RNA探針的弊端，配以自身級聯放大檢測原理，可以高效敏感地檢測到目標RNA。該方法的具體優勢如下：
應用廣泛
使用RNAscope技術，靶點RNA為大于等于300個堿基的特異序列，即可進行探針設計。因而RNAscope技術可以應用于幾乎所有物種，所有組織以及所有基因的檢測。
特異性強
RNAscope獨特的雙Z（ZZ） 探針設計有效的防止了探針的非特異性結合，同時降低了背景干擾。由于結合在非特異性位點的單個的Z 探針不會產生完整的信號放大分子結合位點，并會在雜交過程中被洗脫掉，從而防止非特異性信號的放大，使得探針的信號具有高度特異性。探針設計合成需要2~4周時間即可完成。
靈敏度高
RNAscope方法檢測每個RNA 分子時，只需三對雙Z（ZZ）探針即可完成雜交和信號的可視化。
單分子可視化和單細胞定量
使用RNAscope技術雜交上三對及以上雙Z 探針即可在標準的顯微鏡下呈現可觀察到的點狀信號。ACD公司提供的分析軟件更可以定量每一個單細胞內RNA 的表達水平。
兼容降解的RNA
由于RNAscope三對雙Z探針即可檢測到目標RNA，而通常針對靶點RNA設計的探針為20對雙Z 探針，因而即使目標RNA發生部分降解，仍可以穩定有效地檢測到靶點RNA。
檢測結果穩定一致性
RNAscope技術用到的探針以及所有檢測試劑全部由工業化合成，且該技術針對不同樣本類型（冰凍切片， 石蠟切片，懸浮細胞，貼壁細胞等）已經有成熟的實驗操作流程，故使得RNAscope技術檢測結果具有穩定性和一致性。除了可以在實驗室進行手工操作外，該產品也可以在Leica以及羅氏Ventana自動平臺上運行，為結果的一致性和穩定性提供了可靠的依據。
多通道多靶點同時檢測
由于RNAscope技術可以同時進行多通道探針雜交以及信號放大，故在可見光檢測中可以在同一張切片上同時檢測兩個靶點；而在熒光檢測過程中，可以在同一張切片上檢測三個或三個以上靶點RNA。
在RNAscope技術的基礎上，ACD公司旗下的Basescope技術可以檢測RNA水平的外顯子跳躍，點突變，環狀RNA等；miRNAscope可以原位對小RNA，包括miRNA, siRNA, ASO進行追蹤定位；而近年來推出的RNAscope HiPlex技術則可以在一張石蠟切片上同時檢測最多12個RNA靶標的分布定位，成為神經科學，腫瘤微環境研究以及單細胞測序后驗證等領域的常用檢測方法。